免疫診斷試劑是廣泛應用的一種測試系列，通過抗體-抗原結合來檢測特定目標。這可能涉及使用實驗性抗體來檢測特定蛋白質的存在，也可能使用重組蛋白來檢測天然抗體的存在。

在開發、使用免疫診斷試劑或排除故障時，都需要考慮一些共同的影響因素以獲得最佳反應體系系統。本文將介紹一些技巧和竅門，以幫助完善免疫診斷試劑并取得最佳測試結果。

1. 主要原料選擇

花時間選擇一個好的免疫原料會節省大量的檢測開發時間，并產生更好質量的免疫診斷試劑。所選擇的免疫原料最好是純的，并且結構上與目標分析物相同。建議嘗試多個廠家抗體，這可能包括同一目標的不同表位抗體、多克隆與單克隆抗體、不同宿主物種的抗體，甚至不同供應商提供的抗體。

抗體即使是來自不同批次或供應商的相同抗體，也會在檢測效果上表現出固有差異。不同表位的抗體在不同樣品類型或條件下結合的可用性也可能不同，所以確保檢測方法與實際使用的樣品類型相匹配。

2. 其他輔料影響因數

雖然抗原抗體是免疫檢測的核心，但實驗過程中還涉及一系列其他試劑和材料，這些因素將對檢測結果產生重要影響。

以Western blot為例，可以利用多種具有不同特性的膜類型進行印跡。即使選擇了一種膜類型，在不同制造商生產的同等膜之間也可能存在性能上的差異，橫向流動膜也是如此。在使用塑料器皿固定的免疫診斷試劑如ELISA時，可供選擇的材料和表面處理以及結合特性各不相同，這些因素都會影響測定的有效性。因此，在選擇合適的試劑時，不要滿足于手頭的材料，而是嘗試不同的選擇和不同品牌，并進行平行試驗以找到最佳結果的產品。

3. 提供穩定的緩沖液

緩沖液提供了免疫診斷試劑中的反應環境，所以選擇合適的緩沖液條件非常重要。除了嘗試不同的緩沖溶液外，還需要嘗試不同濃度的溶液。

即使是微小的濃度差異也可能導致檢測成功或失敗。這不僅適用于檢測過程本身的緩沖液，也適用于上游過程中使用的緩沖液，如重組蛋白的制備或樣品的儲存，因為這些緩沖液可能會帶入免疫檢測中并產生干擾，一定程度上破壞了主要原材料的穩定性。

4. 妥善保管樣品

即使掌握了最佳的檢測方法，樣品質量差或未得到適當保管也可能導致失望的結果。從采集樣品開始，就要妥善保管好樣本，我們在實際開發過程中，樣本往往是醫院帶回來的，在帶回途中必須控制好儲存穩定！樣本包括血液、血漿、血清、組織、細胞、微生物等，保管得越好，結果就越相關和有意義。

特別是對于臨床診斷試劑，保存時間會影響陽性和陰性結果，不論是假陰性還是假陽性結果都是不希望看到的。隨著時間推移，蛋白質（包括抗體）會降解，而溫度升高、pH值變化、滲透壓變化和破壞性化學物質等因素會加速降解。

理想的保管條件主要取決于樣品類型，所以做足功課很重要。通常，低溫和生物相關的緩沖條件可能是最好的選擇。但對某些樣品類型可能導致目標蛋白的損傷和降解，反復凍融對大多數樣品肯定是有害的，必須要去醫院拿新鮮樣本測試開發。

5. 徹底清洗反應體系

許多免疫診斷試劑都是多組分試劑，需要儀器進行多次吸取不同試劑組分和樣本，在完成最終動作之后就必須進行清洗。雖然清洗步驟可能看起來不那么重要，但它們卻是至關重要的。清洗不徹底會導致高背景信號，產生“噪音”結果。另一方面，過度清洗可能使信號減弱甚至消失。

在其他方法學上，不一致的洗滌還會帶來其他問題，導致實驗內和實驗間的差異以及結果解釋上的困難。當整個板塊或樣品出現無法解釋的變化時，可能是由于單個實驗中的洗滌不一致造成的。

以96孔板式檢測為例，如ELISA，在使用自動洗板機時，最好檢查所有孔是否被均勻清洗。由于自動洗板機所需的細管易堵塞，因此在派發實驗板之前，用一個空板檢查所有孔是否均勻分配和排空。如果使用多通道移液器手動進行操作，請確保所有吸頭牢固、平衡地安裝，以防止洗滌液的分配和排空不均。例如，在清洗膜時，確保膜完全浸沒，因為暴露部分將保持未被清洗。使用磁力攪拌器輕輕攪拌洗滌液也是一個好主意（不要過于用力，以免損壞膜），以使洗滌液在整個膜上均勻循環。

6. 使用質控品

與大多數測試一樣，包括適當的質控很重要，以確定實驗過程中獲得的結果的有效性。不包括質控意味著無論結果看起來多么好，都是沒有意義的。

陰性質控可以將無信號解釋為沒有目標存在，而不僅僅是檢測失敗。例如，在許多LFA中，即使測試帶是陰性的，也會包括一個控制線以確認檢測成功。同樣地，陽性質控表明了目標存在于樣品中的信號。

例如，在 Western Blot 檢測細胞裂解液中特定蛋白時，同時進行純化的目標蛋白樣品可幫助識別背景信號中的目標帶。質控品跨越目標濃度或表達水平范圍也有助于解釋未知樣品中的水平，對定量或半定量測定特別重要。對于ELISAs，確定病人樣品中某種抗體的水平是低、中還是高，有助于臨床解釋，并確保結果保持在檢測動態范圍內。

7. 考慮同時檢測多個目標

在一次檢測中同時檢測多個目標可能是可取的。添加一個以上的目標到診斷測試中可以提高測定的可靠性、敏感性和特異性，特別是當目標可能丟失或變異到不能有效檢測時。此外，宿主對抗原的反應存在自然差異，因此將不同的目標組合在一起，可以從一個樣品中檢測多個病原體或與之相關的免疫反應。

這些建議的目的是幫助優化免疫診斷試劑并獲得最佳結果。