對蛋白質進行標記和偶聯操作可以賦予其新的功能，便于檢測、定位或者用于構建復雜的生物分子體系。其中，基于氨基反應的蛋白質標記和偶聯方法是一類非常重要的技術手段。

1、氨基在蛋白質中的存在形式與特性

1）氨基酸結構中的氨基：蛋白質由氨基酸組成，許多氨基酸都含有氨基基團（-NH?）。在組成蛋白質的20種常見氨基酸中，例如賴氨酸（Lys），其側鏈上含有一個可反應的氨基。這些氨基在蛋白質的三維結構中分布在不同的位置，有的暴露在蛋白質表面，容易與外界試劑發生反應，而有的可能由于蛋白質折疊而被包埋在內部，不易被觸及。

2）氨基的化學性質：氨基具有一定的堿性，可以接受質子形成 -NH??。這種堿性特性使得氨基在不同的pH條件下具有不同的反應活性。在偏中性到堿性的環境中，氨基能夠與帶有活性官能團的化合物發生親核取代反應或縮合反應等。氨基可以與羧基發生縮合反應形成酰胺鍵，這一反應在蛋白質偶聯過程中經常被利用。

2、常見的基于氨基反應的蛋白質標記和偶聯方法

1）戊二醛法：戊二醛是一種帶有兩個活性醛基的雙功能連接劑。它能夠借助兩端的醛基與蛋白質的氨基以共價鍵連接。反應機制涉及到醛基與氨基首先反應生成亞胺（西佛堿，schiff base）。反應條件相對溫和，可以在4-40°C，pH 6.8-9之間反應，反應時間通常控制在2-5小時。一般室溫下即可反應，如果反應物活性較高，也可以在4°C條件下反應。在磷酸緩沖液（pH6.8- 7.5）或者碳酸緩沖液（pH8-9）中都能進行反應，而且通常pH越高，西弗堿的生成率越高。這種方法的優點是操作簡單，連接效率較高。然而，也存在一些局限性，例如生成的西佛堿在反應條件下不是很穩定，可能會發生進一步的聚合反應，需要對反應條件進行精確的控制以確保偶聯的穩定性。

2）碳化二亞胺法：碳化二亞胺類試劑（如EDC）是常用的偶聯試劑。它能夠活化含有羧基的化合物，使其與蛋白質的氨基發生反應形成酰胺鍵。在反應過程中，碳化二亞胺首先與羧基反應形成一個活性中間體，這個中間體隨后與氨基反應完成偶聯。反應通常在水相體系中進行，并且可以通過調節pH來優化反應效率。一般來說，pH在4.5-6.0之間比較適合。優點是可以在水溶液中進行反應，對許多生物分子的活性影響較小。但是，反應過程中可能會產生一些副反應，需要對反應體系進行適當的優化以提高特異性。

3）重氮法：芳香族伯胺在低溫（0 - 5°C）和強酸（鹽酸或硫酸）溶液中與亞硝酸鈉作用，生成重氮鹽的反應稱為重氮化反應。若環上具有 -NO?或 -SO?H等的芳胺可以在較高一些（40-60°C）溫度進行重氮化反應。重氮鹽在弱酸、中性或堿溶液中與含有氨基的蛋白質作用，由偶氮基（N = N）將兩個分子偶聯起來，生成偶氮化合物的反應，稱為偶聯反應。這種方法的偶聯反應是親電取代反應，重氮陽離子是弱的親電試劑，它進攻蛋白質氨基所在位置苯環上電子出現幾率密度比較大的碳原子。反應需要嚴格控制反應條件，包括溫度、pH和反應物濃度等，以確保反應的特異性和效率。

3、蛋白質標記和偶聯過程中的關鍵因素

1）緩沖液體系：緩沖液的種類和pH值對氨基反應的偶聯過程至關重要。不同的偶聯方法可能需要特定的pH范圍來確保反應的最佳效率。例如，碳化二亞胺法在pH4.5-6.0之間較為合適，而戊二醛法在pH6.8-9之間反應較好。合適的緩沖液還可以維持蛋白質的結構和活性，防止蛋白質在反應過程中變性。

2）反應溫度和時間：反應溫度和時間需要根據具體的偶聯方法和反應物的特性來確定。一般來說，較低的溫度可以減少副反應的發生，但可能會降低反應速率。戊二醛法在室溫到40°C都可以反應，而重氮法需要嚴格控制溫度在0 - 5°C或者40 - 60°C（根據芳胺的結構）。反應時間過長可能會導致不必要的副反應或者蛋白質變性，時間過短則可能導致偶聯不完全。

3）反應物濃度和比例：蛋白質與標記或偶聯試劑的濃度和比例會影響偶聯的效率和特異性。如果標記試劑濃度過高，可能會導致非特異性結合或者過度修飾，影響蛋白質的活性。如果濃度過低，則可能導致偶聯不完全。