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同一抗體,跑出來不同分子量的原因

時間:2025-02-09   訪問量:533

在生物學實驗中,同一抗體在不同條件下進行電泳等分析時,跑出來的分子量卻不一樣,常常會出現這樣的事情。有以下幾個方面因素:

  1. 抗體本身的結構特點

抗體是具有4條多肽鏈的對稱結構,包含2條較長、相對分子量較大的相同重鏈(H鏈)和2條較短、相對分子量較小的相同輕鏈(L鏈),鏈間由二硫鍵和非共價鍵聯結形成一個由4條多肽鏈構成的單體分子 。抗體存在多種形式,除了常見的單體形式,還可以形成多聚體。比如,IgM抗體在體內通常以五聚體形式存在,而在某些實驗條件下,其聚合狀態可能發生改變,從五聚體解離成單體或其他聚合程度不同的形式。這種聚合狀態的變化會直接影響其在電泳等分析中的遷移率,從而表現出不同的分子量。

2.翻譯后修飾也會影響抗體分子量

抗體在細胞內合成后,會經歷一系列的翻譯后修飾過程,其中糖基化最為常見。不同的細胞表達系統,由于其自身的糖基化酶種類、活性以及細胞內環境等因素的差異,會導致抗體糖基化程度不同。

以在哺乳動物細胞和昆蟲細胞中表達的同一抗體為例,哺乳動物細胞表達的抗體可能具有更復雜、多樣化的糖基化修飾,而昆蟲細胞表達的抗體糖基化程度相對較低。糖基化的差異會使抗體的分子量增加不同的程度,進而在電泳等實驗中呈現出不同的分子量結果。此外,磷酸化、乙酰化等其他翻譯后修飾方式,也在一定程度上改變抗體的電荷性質和分子大小,影響其在電場中的遷移行為,造成分子量測定的差異。

3.實驗條件不同

3.1電泳緩沖液的成分和pH值對抗體的遷移有顯著影響:不同的緩沖液配方會影響抗體分子所帶的電荷數量和性質。例如,在pH值較高的緩沖液中,抗體分子帶有更多的負電荷,遷移速度相對較快;而在pH值較低的緩沖液中,電荷數量和性質的改變使遷移速度發生變化,最終導致分子量測定結果出現偏差。

3.2樣品處理過程:在制備樣品時,還原劑的使用與否以及其濃度會影響抗體分子間二硫鍵的狀態。如果二硫鍵沒有被充分還原,抗體會以多聚體或部分折疊的形式存在,導致遷移異常。同時,樣品的上樣量如果過大,會造成電泳條帶的擴散和拖尾現象,影響對分子量的準確判斷。

3.3 凝膠的濃度和交聯度也會對抗體的遷移產生影響:不同濃度的凝膠孔徑大小不同,抗體在不同孔徑的凝膠中遷移的阻力不同。一般來說,較高濃度的凝膠孔徑較小,適合分離分子量較小的蛋白質或抗體;而較低濃度的凝膠孔徑較大,更有利于分子量較大的抗體遷移。如果在實驗中選擇了不合適的凝膠濃度,就導致抗體遷移異常,出現分子量測定不準確的情況。

3.4 儀器設備的差異以及校準情況:不同品牌和型號的電泳儀、成像系統等設備,其性能參數和分辨率存在差異。而且,如果儀器沒有定期進行校準和維護,也會影響實驗結果的準確性,使得同一抗體在不同設備上跑出不同的分子量。

在進行實驗時,我們需要充分考慮這些因素,盡可能優化實驗條件,準確分析實驗結果,以獲得可靠的抗體分子量數據。



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