在免疫層析試紙條開發中，C線（質控線）的穩定性和可靠性直接決定了檢測結果的有效性。C線的形成依賴于二抗與標記抗體（如膠體金標記的抗體或熒光標記的抗體）的特異性結合。

在研發過程中，選擇合適的C線二抗是確保試紙條性能的關鍵步驟。今天從二抗的來源、特性、性能優化及實際應用等多個方面和大家聊聊C線二抗的選擇策略。

一、二抗功能與要求

C線位于試紙條的質控區，其作用是通過二抗與標記抗體的結合，驗證試紙條的完整性和檢測流程的正確性。無論樣本中是否含有分析物，只要試紙條正常運作，C線均應顯色。因此，C線二抗需滿足以下核心要求：

1）高度特異性?：僅與標記抗體結合，避免與其他成分發生交叉反應。

2）高親和力?：能夠快速、穩定地與標記抗體結合，確保顯色強度一致。

3）穩定性?：在試紙條的儲存和運輸過程中保持活性，避免因環境變化（如溫度、濕度）導致失效。

二、二抗選擇策略

1）二抗來源的匹配性?：C線二抗的選擇需與標記抗體的來源物種嚴格匹配。若標記抗體為小鼠來源的IgG抗體，則C線二抗應選擇抗小鼠IgG的二抗（如山羊抗小鼠IgG）。若標記抗體為兔來源的IgG，則需選擇抗兔IgG的二抗。

注意事項?：需確認二抗的種屬特異性。例如，某些二抗可能對多物種IgG有交叉反應（如抗小鼠抗體可能同時識別大鼠IgG），需通過預實驗驗證其特異性。

推薦使用單克隆二抗以提高特異性，但多克隆二抗因結合表位豐富，可能增強顯色信號。

2） ?抗體類型的選擇?：IgG是免疫層析中最常用的抗體類型，但不同亞型（如IgG1、IgG2a、IgG2b等）的二抗結合能力存在差異。

IgG Fc段特異性二抗?：識別抗體的恒定區（Fc段），適用于通用型質控線設計；IgG Fab段特異性二抗?：識別抗體的可變區（Fab段），適用于需要避免與樣本中其他抗體干擾的場景。

如在雙抗體夾心法試紙條中，若標記抗體和檢測抗體均來自同一物種，需選擇Fab段特異性二抗，避免檢測抗體與C線二抗的非特異性結合。

3）親和力的優化?：二抗的親和力直接影響C線顯色的速度和強度。

高親和力二抗?：適合快速檢測（如10分鐘內顯色），但成本較高。

中低親和力二抗?：成本較低，但需延長反應時間或提高標記抗體濃度。

實驗建議?：通過棋盤滴定法優化二抗與標記抗體的濃度比例，平衡顯色速度與成本。

4）?標記方式的適配性：?部分C線設計需要二抗預先偶聯標記物（如膠體金或熒光微球），以增強信號。此時需考慮：

標記效率?：標記過程是否影響二抗的活性。例如，膠體金標記可能因pH變化導致抗體變性。

信號穩定性?：熒光標記需避免光漂白，膠體金標記需防止聚集。

替代方案?：若試紙條采用“裸二抗”設計（即二抗未標記，依賴標記抗體的信號），需確保二抗的固定化效率。例如，通過硝酸纖維素膜（NC膜）的孔徑優化，提高二抗的包被量。

5） ?交叉反應性的規避?：若樣本中含有與二抗可能交叉反應的成分（如人血清中的異嗜性抗體），需采取以下措施：

預吸附處理?：選擇經過預吸附（Pre-adsorbed）的二抗，去除對常見干擾物的結合能力。

添加阻斷劑?：在試紙條的樣品墊或結合墊中添加惰性蛋白（如BSA、酪蛋白），減少非特異性吸附。

三、過程中的問題與解決方案

1） ?C線顯色弱或不顯色?

原因?：二抗濃度不足、標記抗體失活、NC膜包被不均勻。

解決方案?：提高二抗包被濃度；更換批次標記抗體；優化NC膜的固定化條件（如調整緩沖液pH）。

2）?C線顯色過快或拖尾?

原因?：二抗親和力過高、層析速度過慢。

解決方案?：降低二抗濃度；調整試紙條的金標墊或樣品墊的釋放速度。

所以，C線二抗的選擇是免疫層析試紙條研發中的核心環節，需從特異性、親和力、穩定性等多方面綜合評估。