免疫層析技術作為快速診斷領域的核心方法，其核心原理依賴于標記抗體與目標抗原的特異性結合反應。標記抗體的用量直接影響檢測的靈敏度、特異性及成本效益。

1、基本原理與標記抗體的作用

免疫層析基于抗原-抗體的特異性結合，以固相載體（如硝酸纖維素膜）為反應平臺。標記抗體通常通過熒光素（如FITC）、酶（如HRP）、膠乳顆粒或量子點（QDs）等標記物進行功能化，以實現可視化或儀器化檢測。

標記抗體的作用包括：

信號生成：通過酶促反應、熒光激發或膠乳聚集產生可檢測信號；

定位識別：與目標抗原結合后，形成“檢測線”或“對照線”復合物；

動態響應：在層析過程中隨液體流動實現快速反應。

2、標記抗體用量過多的負面影響

1）非特異性結合增加，降低檢測特異性

過量標記抗體易與固相載體或其他非目標蛋白發生非特異性吸附。例如：

抗體FC段干擾：小鼠單克隆抗體的FC段可能被類風濕因子（RF）或異嗜性抗體（如HAMA）識別，導致假陽性；

電荷吸附：硝酸纖維素膜表面帶負電，過量抗體（尤其是帶正電的標記物）可能通過靜電作用非特異性結合，增加背景噪聲。

在膠乳標記免疫層析中，過量抗體會導致膠乳顆粒在層析膜上非特異性聚集，形成假陽性條帶。

2）信號過載與檢測范圍受限

標記抗體濃度過高可能引發信號過早飽和，具體表現為：

熒光猝滅：FITC標記時，單個抗體分子結合超過15-20個熒光素會因分子間能量轉移導致熒光效率下降；

酶活性抑制：HRP標記抗體過量時，底物反應速率超出線性范圍，無法準確反映低濃度抗原水平。

實驗數據：研究表明，當FITC標記量超過20個/抗體分子時，熒光強度反而下降30%-50%。

3）流動效率降低

免疫層析依賴毛細作用推動液體流動，過量標記抗體可能：

堵塞膜孔徑：大分子標記物（如膠乳顆粒）過量時，易在膜纖維中沉積，減緩層析速度；

競爭性結合：過量抗體會提前消耗反應體系中的抗原，導致檢測線信號減弱甚至消失。

優化策略：通過透析法或凝膠層析（如葡聚糖G-25）去除未結合的游離標記物，可顯著提升層析效率。

4）成本浪費與批次穩定性風險

標記效率下降：抗體與標記物的摩爾比需精確控制（如FITC標記推薦1:10-1:20）。過量標記不僅浪費昂貴試劑，還可能破壞抗體空間構象，降低結合活性；

批次間差異擴大：大規模生產中，過量標記會導致不同批次產品的信號強度波動，增加質控難度。

3、標記抗體用量技巧

1）標記方法的精準定量

熒光標記：通過Marshall直接法或透析法控制FITC與抗體的摩爾比，結合紫外分光光度計測定F/P值（熒光素/蛋白比），確保其介于1.5-2.5之間；

酶標記：采用棋盤滴定法確定HRP與抗體的最佳比例，通常以酶活性單位（U/mg）為指標。

2）層析介質與標記物的適配性優化

孔徑匹配：選擇孔徑5-10μm的硝酸纖維素膜，避免膠乳或量子點顆粒（粒徑200-500nm）堵塞；

表面修飾：對膜進行BSA或酪蛋白封閉，減少非特異性吸附。

3）智能化工藝控制

利用熒光偏振或表面等離子共振（SPR）實時監測標記效率。