講這個問題之前，首先問大家一個問題，為什么微流控成本這么高，大家還不遺余力地去做探索？答案就在這個“控”字上。對于免疫層析，樣本爬樣有點太隨意了，完全處于一個不受控的狀態，爬樣狀態和結果就像擲骰子，即使我們把能做的功課都做足了，也難免有個別的樣本跟你調皮一下，非得不按套路出牌。雖然這個概率可能不到1%，但是從產品每年的出貨量考慮，比如出貨量是20萬人份/年，不合格條數就是2000條，這2000條不知道會招來多少個投訴。微流控分為被動微流控和主動微流控，被動微流控一般都是僅靠虹吸去爬樣，做到相對可控；主動微流控則會加上傳感器，根據壓力去控制流樣完全可控。當初這個概念剛出來的時候，我就覺得這確實是掀桌子的一個壯舉，但是奈何成本高出普通的膜墊層析太多，并不適合大眾普及。

       再講一個問題，問一下做過層析的同學，層析產品是定性好做，還是定量好做，或者是半定量好做？前些天有人說，好做順序：定量產品＞定性＞半定量。從我個人而言，我沒法給出結論，只能說各有難點。定性產品哪里難？特異性！陰性樣本不允許出現一絲絲的條帶；半定量產品哪里難？不僅僅不讓出假陽，還得嚴格地卡住半定量的那幾個點的條帶深淺；定量產品哪里難？cv不好把控，跟發光產品比，可能就是個學渣級別的，但是陰性樣本允許存在一定的背景條帶，因為軟件可以扣除，講到這里，我大概明白那個朋友做這個排序的依據了，他肯定是做定性產品做多了??！

       上面我們說到了，和微流控的精裝修相比，膜墊搭配的層析就像個毛坯房，樣品墊+結合墊+nc膜+吸水紙，永恒不變的幾大版塊。那么層析這么大的cv，到底能不能控一下呢？在哪里控呢？

1.結合墊用什么？

       和微球直接接觸的就是結合墊，它的類別直接影響了微球的釋放狀態。它的種類實在太多了，目前最主流的就是玻纖和聚酯，但是我們似乎并不在乎它是什么材質，好用就行。從我個人的角度，我喜歡將它們分類成以下幾個方面：

A常見的玻纖。像是奧斯龍的8964，表面上絲絲縷縷的，親水性特別好，蓄水量也特別足，釋放速度快，殘留少，是很多人非常喜歡的一款玻纖。但是，我個人覺得，對于很多新手，可能覺得它并不好用，因為它對于CV方面的把控并不是特別好，因為材質表面的絲絲縷縷，讓很多人做出來的試紙條Stream都非常嚴重，跑出來的線條也是絲絲縷縷，深深淺淺，CV自然也就大了。

B常見的聚酯。聚酯的種類非常多，有像打印紙一樣致密的，也有像奶酪的表面一樣坑坑洼洼的。它們的特點就是親水性普遍都很好，釋放很柔和也很徹底，整體的cv把控要比常見的玻纖要好一些，雖然成本高一些，但更適合新手拿來做定量產品。

C疏水性材質。很多人做時間分辨也好，上轉發光也罷，微球的釋放對他們來說總是個大問題。我用過很多公司的產品，發現很多產品層析完了，結合墊還像沒層析過一樣，殘留的不像話。這種就適合用偏疏水一些的材質，釋放速度很快，釋放殘留非常低，唯一的缺點就是得事先處理才能用。通常情況，疏水的墊子，cv把控中規中矩，噴金量偏大一些，相對能把控的很好。

D結合墊/樣品墊一體材質。目前國外的一些廠家生產出了pet材質的一體墊，既具備玻纖親水性極佳的特點，又具備聚酯釋放均勻柔和的特點，可以說是把優點集中到一起了吧，而且用一個墊子，比用兩個墊子引入的變異肯定更小。不過，它們材質普遍偏厚一些。

2.噴金or鋪金？烘干or凍干？

       這個方面大家應該一目了然，從工序出現的時間先后就可以推斷哪種更好。鋪金的出現都是之前做膠體金定性產品的時候，那時候大部分廠家都還是采用無紡布的年代，如果采用鋪金的工藝來做定量產品，并不是說不行，只不過和噴金相比，確實CV更難把控，因為鋪金的均勻度和干燥過程中的動態變化是比較難以把控的。再說一下烘干和凍干，因為目前熒光顆粒的粒徑都在200nm以上，烘干其實很容易引發顆粒的聚集或者嚴重的邊緣效應，凍干在保持蛋白活性和疏松程度方面都能很好把控，所以凍干毋庸置疑是優于烘干的。所以綜上來看，如果噴金配合凍干，理論上是最優的選擇。但是廠家還得考慮成本問題，在很多方面不得不做出取舍。

3.您的產品堵膜了嗎？

       微球的標記我不想再談了，我只說一下為什么有時候同一批次的條子測試相近濃度的不同樣本，很多時候T和C值差別非常大？我有時候會掰開卡殼觀察不同樣本的測試狀態，發現微球都出現了不同程度的堵膜，暫且不考慮不同樣本堵膜會有差異的問題，就說直接上樣本稀釋液就有堵膜的這種問題，能不能做出改善？對于層析產品，堵膜是一件非常糟糕的事情，不僅CV不好，還會引入非常大的偏差，準確度都成了問題。所以我們需要從各個方面考慮，如何讓我們的微球分散性更好，聚合形式比例更少。比如之前美牛生物提到的，讓標記緩沖鹽離子濃度降到很低等。

4.阻斷劑影響到T和C了嗎？

       目前為了防止類風濕因子或者異嗜性抗體的干擾，阻斷劑的使用變得非常普遍，一般都是加在樣品墊處理液里面。首先考慮這個阻斷劑是不是鼠源的，而你的C線用的是不是羊抗鼠，這樣的話本身體系就存在問題，導致C線很弱；如果樣品墊處理的過程本身就不均勻，那么C線的高低起伏就顯得很正常；同樣地，有時候阻斷劑對于T線也就是特異性反應也會有干擾，不同的樣本干擾程度還不一樣，這又導致了T線的不穩定。所以從這方面考慮，阻斷劑的種類篩選和使用方法就成了很有必要的一項工作。

5.樣本直接上樣？

       靈敏度不夠的時候，迫不得已采用的下策。我們知道，血清樣本什么狀態的都有，有的像清水，有的像豆油，還有溶血的像茶色的花生油。直接上樣，有的爬速正常，有的根本爬不動，CV偏大也就是家常便飯了。還有的廠家測試指尖血，暫且不提紅細胞壓積的差異，我感覺做指尖血的定性對我來說就挺難的，做定量？我都不想談CV這個詞了。不過，不管測全血還是血清，直接上樣的話，濾血膜的使用都是必不可少的，它還多少能給試劑帶來一些正向作用。那么，如果測試的是血漿，不同的抗凝劑帶來的干擾，會不會引發大的變異，也得需要做嚴格的驗證。如果沒做驗證，那就盡量測試血清，別整花活忽悠人。

6.您的卡殼設計的合理嗎？

       卡殼？很多人并不在意，其實這是個加分項。加樣孔的位置，結合墊處的那兩個橫梁的高低，是我最為在意的地方。加樣孔位置偏上，會引發持續或二次層析；橫梁位置靠上，卡殼便失去了意義。恰到好處的設計，能很大程度地控制層析，降低變異。

       這里順便提一下吸水紙的問題。有的吸水紙蓄水量大，但親水性差；有的則是親水性強，蓄水量低。選擇一款合適的吸水紙，或者選取2款搭配使用，也是一個加分項。

7.膠體金定量or熒光微球定量？

       從之前的研發經驗和儀器對比來看，目前具體用哪種載體來定量已經變得沒那么重要了。膠體金的儀器目前響應已足夠靈敏，CV也并不輸于熒光儀器。如果從顆粒的大小來考慮，膠體金(20-40nm)在靈敏度方面確實比熒光微球(200-400nm)低一些。但是，有意思的是，對于上述提到的直接上樣的樣本，通常膠體金跑出來的CV，反而是優于熒光微球的，它表現出的抗干擾能力更為出色，不知道是不是僅僅是出于顆粒大小的影響。

文章來源于IVDdiagnosis，作者IVDdiagnosis